超越贝伐珠单抗！人源化抗 VEGF 纳米抗体理性改造登顶 BMC Biotechnology

核心靶点：VEGF——病理性血管生成的“总开关”

血管内皮生长因子（VEGF）是调控血管生成的核心细胞因子，其中VEGFA是驱动病理性血管生成的关键亚型，通过结合VEGFR1/2受体，促进内皮细胞增殖、迁移与血管新生。VEGF异常高表达，直接导致湿性年龄相关性黄斑变性（AMD）、糖尿病视网膜病变、黄斑水肿等眼底致盲疾病，同时也是实体肿瘤血管生成、侵袭转移的核心驱动因素。

图1血管内皮生长因子（VEGF）/VEGF受体（VEGFR）的结构、它们的相互作用及结合模式^[1]

图2  VEGF-A/VEGF受体2信号通路介导癌症内皮细胞血管生成^[2]

当前临床抗VEGF治疗以贝伐珠单抗（Avastin） 为代表，作为首个获批的抗VEGF全长人源化单抗，已广泛用于结直肠癌、肺癌及眼底病变治疗。但传统抗体存在分子量大（~150 kDa）、组织穿透性差、生产成本高、需频繁玻璃体腔注射、患者依从性差等局限，难以满足长期治疗需求。因此，开发更小、更强、更安全、更经济的下一代抗VEGF药物，成为生物医药领域的迫切需求。

核心技术：计算驱动的纳米抗体理性亲和力成熟

纳米抗体（Nanobody，VHH）是骆驼科动物重链抗体的可变区，是自然界最小的完整抗原结合单元，分子量仅11–15 kDa，具备传统抗体无法比拟的优势：结构稳定、耐热耐化学、原核表达高效、组织穿透极强、可识别传统抗体无法结合的隐蔽表位。但其天然亲和力通常低于全长单抗，成为临床转化的主要瓶颈。

本研究建立“计算机模拟→分子改造→实验验证”全流程技术体系，精准实现人源化纳米抗体亲和力跃升：

• 结构预测与分子对接基于AlphaFold2与Colabfold完成野生型人源化抗VEGF纳米抗体（WHNb）同源建模，以PDB:2VPF的VEGFA为靶点，通过ClusPro完成蛋白蛋白对接，确定结合界面与关键热点残基（R99、R114、Y115）。
• 定点理性突变设计使用OSPREY与Nanome软件，在非热点区域引入静电相互作用增强型突变，构建12个突变体，通过PRODIGY预测结合亲和力，筛选高潜力候选株。
• 100 ns分子动力学模拟采用GROMACS完成复合物动力学模拟，以RMSD、Rg、SASA、氢键等指标评估结构稳定性，确保突变不破坏整体折叠。
• 伞形采样（Umbrella Sampling）精准评估结合自由能通过PMF曲线计算结合自由能ΔG，定量比较突变体与VEGF的结合强度，最终锁定MHNb136、MHNb256两个最优突变体。
• 原核表达纯化与SPR亲和力验证在大肠杆菌中实现突变体可溶性高表达，经Ni柱亲和纯化后，采用Biacore SPR系统完成亲和力定量，并在人视网膜色素上皮（RPE）细胞完成安全性评价。

关键数据结果：亲和力全面超越贝伐珠单抗

结合自由能显著提升

• 野生型WHNb：ΔG =−19.05 kcal/mol，MHNb256：ΔG =−39.30 kcal/mol，MHNb136：ΔG =−32.64 kcal/mol。
• 突变体结合强度较野生型提升1.7~2.1倍，结合更稳定、更难解离。

SPR实测亲和力碾压临床金标准

以贝伐珠单抗(A)（KD = 7.49 nM）为对照：

• MHNb136(C)：KD =1.09 nM，亲和力提升6.87倍；
• MHNb256(D)：KD =1.74 nM，亲和力提升4.30倍；
• 野生型WHNb(B)：亲和力较贝伐珠单抗提升2.83倍。

体外安全性优异

• 在12.5、25、50、100 μg/mL全浓度范围，MTT实验与细胞形态学观察证实：MHNb136、MHNb256对人RPE细胞无毒性、无凋亡诱导、无增殖异常，眼科应用安全性充分保障。

相互作用机制优化

• 突变体通过新增盐桥与静电作用强化结合，而非依赖氢键数量，实现更高强度、更高特异性的VEGF识别，为长效抑制奠定结构基础。

人源化纳米抗体的核心提升价值

• 人源化彻底降低免疫原性人源化改造最大程度还原人类抗体框架序列，消除异种免疫风险，可安全用于人体反复长期给药，完美适配眼底疾病与肿瘤慢性治疗需求。
• 极小分子带来超强组织穿透11–15 kDa的尺寸使其能快速穿透视网膜屏障、肿瘤致密基质，到达传统抗体难以渗透的病灶区域，实现更均匀、更深度的靶点覆盖。
• 生产经济化，大幅降低治疗成本可在大肠杆菌中快速高表达，无需昂贵的哺乳动物细胞体系，生产成本降低一个数量级，让高端靶向药更可及。
• 结构稳定，适配更多给药场景耐酸碱、耐高温，可开发为眼用制剂、冻干制剂、局部给药等多样化剂型，提升临床使用便利性。
• 理性改造解决天然亲和力短板本研究证明：计算辅助亲和力成熟可将纳米抗体从“潜力分子”升级为超越临床一线药物的强效候选，打通从基础研究到临床转化的关键壁垒。

总结

本研究以VEGF为核心靶点，通过计算模拟驱动的理性亲和力成熟技术，成功打造人源化抗VEGF纳米抗体MHNb136，其亲和力较贝伐珠单抗提升近7倍，且体外安全性优异。这一成果不仅验证了人源化纳米抗体在分子大小、生产工艺、组织穿透、免疫安全性上的全面优势，更证明理性改造可彻底解决纳米抗体亲和力不足的行业痛点。作为下一代抗体药物，人源化纳米抗体将重构眼底疾病与肿瘤抗血管生成治疗格局，以更高疗效、更低成本、更优依从性，为全球患者带来真正可及的创新疗法。

武汉纳博生命科技有限公司是由武汉产业创新发展研究院牵头成立建设的纳米抗体产业平台。在武汉生物城精准医疗产业基地拥有占地面积达1400㎡的自主实验室，并在武汉左岭与黄冈团风分别建立了符合实验动物标准的羊驼实验基地与转运基地，目前基地在饲养的羊驼共200余头，可为科研机构及抗体药物研发企业提供“零免疫背景”保障的羊驼免疫服务。

纳博生命专注于纳米抗体的研发、改造与应用，致力于打造产学研一体化的实验公共服务平台。公司已建成覆盖抗原制备（多肽、蛋白及 RNA）、抗体发现与工程化改造、生物学功能验证与筛选的全链条技术平台。其中 RNA 抗原包含经序列与结构优化、适用于羊驼免疫的 RNA 产品。依托自主 NabLib® 平台，公司采用 pDual 改进型双功能噬菌体展示技术，在保留传统噬菌体展示高效开发优势的同时，可无缝衔接哺乳动物细胞高效表达，显著提升问题分子的筛除效率；其 NabLib® 哺乳动物细胞展示技术，既能提高抗体分子可开发性，又可灵活选择筛选构型，为下游抗体应用与检测提供可靠保障。公司通过多平台协同互补，为药企及科研院所提供灵活高效的抗体发现与改造服务，助力创新药物与诊断试剂研发。

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