近日，由四川大学华西医院生物治疗国家重点实验室与癌症中心主导，联合重庆市健康资源创新研究院、成都血液中心、四川省人民医院、西部战区总医院等多个机构合作完成并发表于《Cell Reports Medicine》的一项研究创新性地开发出了一款基于纳米抗体的三特异性NK细胞衔接器1H6-15-NKCE，为解决T细胞恶性肿瘤治疗瓶颈提供了全新方案。该研究成功筛选出高亲和力抗CD5 scFv和特异性抗CD16a纳米抗体（P60），构建双特异性NK细胞衔接器1H6-NKCE，该分子可高效激活NK细胞，杀伤CD5+肿瘤细胞。进一步融合IL-15Rα/IL-15复合物构建的三特异性衔接器1H6-15-NKCE，显著增强NK细胞增殖、存活及细胞毒性，体内外实验均展现出强效抗肿瘤活性，并且未观察到针对正常T细胞的“脱靶毒性”，安全性与疗效均优于CD5-CAR-T疗法。让我们一起来详细解读这项突破性的研究吧。
抗CD5 scFv与抗CD16a纳米抗体的筛选及鉴定
研究团队首先通过小鼠免疫与杂交瘤技术，获得4株抗CD5阳性克隆，将其重链可变区（VH）与轻链可变区（VL）通过（G₄S）₃ linker连接形成scFv，并与人类IgG4 Fc融合表达。流式细胞术与酶联免疫吸附试验（ELISA）显示，克隆1H6对CD5+肿瘤细胞的结合特异性与亲和力显著优于2D7，SPR测定显示1H6具有高亲和力（KD=1.02 nM）。
为获得特异性结合CD16a的纳米抗体，研究团队用CD16a胞外域免疫羊驼，构建重链可变区（VHH）噬菌体文库，经4轮淘选后，筛选出仅结合CD16a而不结合CD16b的克隆P60。BLI实验证实了P60对CD16a的特异性结合，亲和力达9.6nM（158V）和15.6nM（158F），而与CD16b无结合，从而避免了因结合CD16b可能引发的体内副作用。
图1：抗CD5 scFv及抗CD16a纳米抗体筛选与表征
双特异性NK衔接器1H6-NKCE的构建与体外活性验证
研究团队将抗CD16a纳米抗体P60与抗CD5 scFv通过人IgG4 Fc进行连接，构建双特异性衔接器1H6-NKCE，SDS-PAGE证实其正确表达与纯化。ELISA与BLI验证显示，1H6-NKCE可同时结合CD5和CD16a（158V/F），且不结合CD16b。
体外杀伤实验表明，1H6-NKCE可显著激活NK细胞，其对于CCRF-CEM、MOLT-4、Jurkat等CD5+肿瘤细胞的杀伤活性显著高于单独使用1H6或P60，而对CD5-的Raji细胞无杀伤作用。实时细胞分析显示，1H6-NKCE在60小时内持续杀伤HeLa-CD5细胞，且对未转染CD5的HeLa细胞无作用，证实其杀伤特异性。CD107a脱颗粒实验显示，1H6-NKCE处理后CD107a+NK细胞比例显著升高，RNA测序分析表明，经1H6-NKCE处理的NK细胞中，与II型干扰素反应、TNF-α信号通路及非经典NF-κB通路相关的基因集显著富集。
图2：1H6-NKCE的体外活性
三特异性衔接器1H6-15-NKCE的构建与功能增强验证
鉴于IL-15可增强NK细胞增殖、存活与细胞毒性，且避免调节性T细胞介导的免疫抑制，团队将可溶性IL-15Rα sushi结构域与IL-15形成的复合物融合至1H6-NKCE的C端，构建三特异性衔接器 1H6-15-NKCE，SDS-PAGE与ELISA证实其正确表达且含功能性IL-15。
体外实验显示，1H6-15-NKCE处理后，残留CD5+肿瘤细胞比例显著低于1H6-NKCE与IL-15-Fc处理组。对不同供体来源的NK细胞，1H6-15-NKCE均能显著增强其对CD5+肿瘤细胞的杀伤活性，且在效应细胞与靶细胞（E:T）比例为10:1时效果最显著。RTCA显示，1H6-15-NKCE激活的NK细胞对HeLa-CD5细胞的长期杀伤效果优于1H6-NKCE，且未观察到NK细胞自相残杀（fratricide）现象。对3例CD5+原发性T-ALL样本，1H6-15-NKCE介导的异源及自体NK细胞均展现更强的肿瘤清除能力。
图3：1H6-15-NKCE对NK细胞的功能增强
1H6-15-NKCE的作用机制与细胞安全性验证
转录组分析显示，与1H6-NKCE相比，1H6-15-NKCE处理的NK细胞中，免疫反应、细胞因子信号、趋化等通路显著富集，JAK/STAT通路因IL-15信号激活而上调，IFN-γ、GZMB、TNF等细胞因子分泌量显著增加。CD69激活标志物与CD107a脱颗粒标志物检测证实，1H6-15-NKCE可更强地激活NK细胞。
图4：转录组学机制分析与1H6-15-NKCE相关
增殖实验显示，与1H6-NKCE或单独IL-15处理相比，1H6-15-NKCE能更有效地诱导NK细胞增殖，在培养7天后显示出更高的增殖比例与细胞存活率，且仅激活正常T细胞增殖，不促进CD5+肿瘤细胞增殖。
图5：1H6-15-NKCE有效诱导NK细胞存活与增殖
体内抗肿瘤活性与安全性验证
在CCRF-CEM-ffLuc异种移植模型中，1H6-15-NKCE联合NK细胞治疗组的肿瘤负荷显著低于1H6-NKCE组，中位生存期从40天延长至 50天（p<0.01），外周血与脾脏中NK细胞数量显著增多，证实其可增强NK细胞体内持久性。
图6：1H6-15-NKCE的抗肿瘤活性
与CD5-CAR-T疗法对比，1H6-15-NKCE激活的NK细胞在体外对 CD5+肿瘤细胞的杀伤活性相当，但对正常自体T细胞无毒性，而CD5-CAR-T细胞会同时杀伤正常T细胞与肿瘤细胞。在MOLT-4-ffLuc异种移植模型中，1H6-15-NKCE联合NK细胞治疗组与CD5-CAR-T治疗组均显著抑制肿瘤生长，但1H6-15-NKCE组小鼠体重无明显下降，血清中IL-6水平较低，提示其引发细胞因子释放综合征的风险较低，且 2/5小鼠在60天仍存活，疗效与安全性更优。
图7：CD5-CAR-T & 三特异性NK细胞抗肿瘤活性对比
该研究不仅成功开发了一种具有高度转化潜力的三特异性NK细胞衔接器，更凸显了纳米抗体在下一代免疫治疗中的核心价值。1H6-15-NKCE以其精准的靶向能力、强大的NK细胞激活效应以及卓越的安全性，为T细胞恶性肿瘤的治疗开辟了一条全新路径，也为全球免疫治疗领域注入了新的创新动力。
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