由于YAP缺乏传统小分子药物可结合的口袋结构，长期被归为“不可成药”靶点。而近年兴起的蛋白水解靶向嵌合体（PROTAC）技术为靶向“不可成药”靶点提供了新思路，然而传统小分子PROTAC在靶向YAP时仍面临亲和力有限、肿瘤组织穿透性差等问题。因此，开发能精准靶向YAP的治疗手段，成为突破YAP依赖性癌症治疗瓶颈的关键。由我国多所研究机构联合发表于《Nature Communications》的一项研究开发了一种由纳米抗体介导的bioPROTAC降解技术，可特异性降解肿瘤中的YAP蛋白，为YAP依赖性癌症提供了可行的治疗新策略。
YAP纳米抗体的筛选与表征
研究团队首先以截短的人YAP蛋白为抗原，构建YAP-GST融合蛋白并在大肠杆菌中纯化获得目标蛋白。随后利用纳米抗体噬菌体文库开展三轮生物淘选，在排除仅结合GST的非特异性克隆后，获得12个具有独特CDR3序列的抗YAP纳米抗体，经ELISA实验显示，12个纳米抗体均能特异性结合内源性YAP蛋白，且不与GST结合，其中E3、E4、E8亲和力最优。
通过HA pull-down实验和SPR测试分析证实，这些纳米抗体能够与内源性YAP蛋白特异性结合，且E8纳米抗体明确靶向YAP的 WW2结构域，这一精准结合位点为后续特异性降解提供了分子基础。在YAP基因敲除的MKN45胃癌细胞模型中，E8纳米抗体未表现出非特异性结合，进一步验证了其靶向专一性。
图1：筛选靶向YAP蛋白的纳米抗体
靶向YAP的bioPROTAC构建与活性验证
基于筛选获得的优质纳米抗体，研究团队将E8纳米抗体与E3泛素连接酶RNF4的RING结构域融合，成功构建YAP-bioPROTAC分子（E8-2RNF4）。该分子通过纳米抗体结构域结合YAP，同时通过RING结构域招募泛素化系统，形成“靶蛋白-降解剂-E3连接酶” 三元复合物，启动YAP的泛素-蛋白酶体降解通路。
图2：YAP特异性纳米抗体的纯化及亲和力测定
在多西环素诱导表达系统中，E8-2RNF4在葡萄膜黑色素瘤、间皮瘤、胃癌等多种YAP依赖性癌细胞系中均表现出强效降解活性，YAP蛋白降解率超过80%。时间进程实验显示，YAP降解的半衰期在 16.8-36.8小时之间，且这一降解过程可被蛋白酶体抑制剂MG132完全阻断，明确证实其通过泛素-蛋白酶体途径发挥作用。
图3：YAP-bioPROTAC诱导YAP降解并抑制肿瘤
功能学实验表明，E8-2RNF4能显著抑制肿瘤细胞增殖，诱导 Annexin V阳性凋亡细胞增加，并有效阻断肿瘤细胞迁移。同时，qPCR检测显示YAP下游靶基因CTGF、CYR61的表达水平显著下调，证实降解剂成功阻断了YAP的转录激活功能。
体内抗肿瘤活性与递送系统优化
在斑马鱼胚胎模型中，E8-2RNF4处理显著抑制了葡萄膜黑色素瘤细胞的扩散，证实其在活体环境中的抗转移活性。在小鼠异种移植瘤模型中，通过多西环素诱导E8-2RNF4表达，能够显著抑制MDA-MB-231乳腺癌、MSTO-211H间皮瘤和IM95胃癌等肿瘤的生长，治疗组肿瘤体积较对照组缩小60%-75%，荷瘤小鼠生存期延长40%以上。
图4：E8纳米抗体与YAP的特异性结合
免疫组化分析显示，治疗组肿瘤组织中YAP蛋白水平显著降低，增殖标志物Ki-67的阳性表达率下降50%，进一步证实YAP降解与肿瘤生长抑制的直接关联。为解决体内递送难题，研究团队开发了基于聚乙烯亚胺/聚谷氨酸（PEI/PGA）的纳米颗粒递送系统，该载体能高效递送YAP-bioPROTAC编码质粒，在肿瘤组织中实现特异性表达。同时，腺相关病毒（AAV9）载体介导的递送策略也显示出良好治疗效果，两种递送方式均未导致小鼠体重明显下降或肝肾功能异常，展现出良好的生物安全性。
图5：YAP-bioPROTAC在体内外的肿瘤迁移抑制活性
纳米抗体在研究中的优势
该研究通过纳米抗体介导的YAP靶向降解技术，成功突破了“不可成药”靶点的研究瓶颈，为肿瘤精准治疗带来了创新性的突破。纳米抗体的精准靶向能力、高亲和力、高特异性、强穿透力和易修饰性使其成为靶向降解系统的核心组件，同时其免疫原性极低、结构稳定，可大规模表达，生产成本低，为临床转化提供便利，其研究成果在多种肿瘤模型中的显著疗效和良好安全性。
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