抗p16纳米抗体库的构建与筛选
为实现这一目标，研究团队首先从构建高亲和力的抗p16纳米抗体库入手。研究人员优化了p16蛋白的表达与纯化，通过添加Avi标签及引入稳定性突变(W15D、L37S、L121R)，显著提升了p16蛋白的产量与均一性。随后用野生型p16和双突变体p16L37S/L121R分别免疫羊驼，构建了两个噬菌体展示纳米抗体库(Library173和174)，库容分别达4.2*1013和6.2*1013。而后采用六种生物淘选策略，包括固相包被p16、p16-CDK6复合物捕获及链霉亲和素捕获生物素化p16等，在经过两轮筛选后，从Library 174中观察到更为显著的富集效果，随后从两个文库的各个策略中均筛选出了独特的阳性克隆。通过CDR3序列比对，将阳性克隆分为6个主要家族(占比超60%)和16个小家族，随机选取20个代表性克隆进行后续分析，其中19个实现高效表达，系统发育树分析显示这些抗体具有不同的结合表位。
图1：纳米抗体家族与结构分析&筛选策略
纳米抗体的生物物理特性鉴定
通过远紫外圆二色谱(far-UV CD)分析，所有纳米抗体均呈现典型的反平行β折叠结构，特征吸收峰位于218 nm，表明其结构完整。热稳定性测试显示，多数纳米抗体的解折叠中点温度(Tm)介于60-80℃，其中NB06为68.3℃，NB09为66.6℃，且部分纳米抗体(如NB04、NB07)具有良好的复折叠能力。
化学变性实验中，15种纳米抗体表现出协同的二态解折叠行为，半数解折叠尿素浓度(D50%)为5-7 M，即使在还原剂DTT存在下，仍能在4M尿素浓度下保持折叠状态。综合热力学稳定性和荧光变性曲线特征，最终筛选出NB03、NB05、NB06、NB09、NB16和NB17六种纳米抗体进行功能验证。
图2：纳米抗体表征
纳米抗体对p16的稳定性调控作用
尿素变性实验显示，野生型p16的D50%为1.94 M，而NB06和NB09可使其分别提升至2.80 M和3.11 M，自由能(ΔGunf)从3.22 kcal/mol分别增至4.65和5.16 kcal/mol，其他四种纳米抗体则无显著稳定作用。表面等离子体共振(SPR)和等温滴定量热法(ITC)证实，NB09(KD=7.52 nM)对p16的亲和力高于NB06(KD=19.98 nM)，且二者结合模式不同(NB06结合为吸热反应，NB09为放热反应)。
图3：纳米抗体对p16的稳定作用
对8种癌症相关p16突变体的测试显示，NB06和NB09能显著稳定R24P、Q50R、D74N和D84N突变体，其中R24P在无纳米抗体时无协同解折叠行为，结合后则恢复典型变性曲线；而P81L、H98P、P114L和V126D突变体因结构破坏过严重，未被有效稳定。
图4：p16突变体结构及纳米抗体稳定效果
p16-纳米抗体复合物的结构解析
研究解析了p16-NB09复合物的晶体结构，分辨率1.79 Å(最高分辨率达1.74 Å)，显示NB09结合于p16的ANK2-ANK3和ANK3-ANK4界面区域，与CDK结合面处于对立面。该结合模式使p16的整体折叠结构未发生显著改变(与p16-CDK6复合物的RMSD为0.693 Å)，为形成三元复合物奠定基础。
界面分析显示，NB09的CDR1、CDR2和CDR3均参与结合，形成的结合界面面积为684.7 Ų，形状互补性系数为0.727，符合典型纳米抗体-蛋白相互作用特征。突变验证表明，p16R99P因位于结合界面无法结合NB09，而CDK结合缺陷突变体D84N仍能正常结合纳米抗体，进一步证实结合位点的特异性。
图5：p16-NB09纳米抗体复合物的晶体结构
三元复合物形成及细胞内功能验证
体外实验显示，GST-CDK6可与p16及NB06/NB09形成三元复合物，均质时间分辨荧光(HTRF)实验证实纳米抗体不影响p16与CDK4/6的结合亲和力。热稳定性测试表明，NB09能与温度敏感突变体p16D108N结合，形成的三元复合物(CDK6-p16D108N-NB09)在52℃仍可被检测到，证实了其在该复合体系中的稳定作用。
细胞实验中，HA标签化的NB09可在HEK293T细胞内结合内源性p16，并通过p16介导捕获CDK4/6。在诱导表达p16的U2OS细胞中，NB09结合不影响p16诱导的G1期阻滞功能，证实其在胞内可维持p16活性。
图6：CDK6-p16纳米抗体复合物的表征
纳米抗体的赋能优势
纳米抗体的高亲和力与特异性可使其以纳摩尔级亲和力特异性结合p16，其中NB09通过CDR1的α螺旋和CDR2/3的氢键网络与p16形成稳定相互作用，可将野生型p16的稳定性提升60%以上。更重要的是，其结合位点避开CDK互作区域，既维持p16功能又实现结构稳定，这是传统小分子抑制剂难以实现的精准调控。其优越的结构稳定性与穿透能力使其在高温、高尿素浓度甚至还原环境下仍保持折叠，小尺寸特性不仅利于晶体结构解析，还能穿透致密肿瘤组织，为后续体内应用提供优势。
晶体结构证实纳米抗体结合不改变p16的功能构象，细胞实验进一步验证其可与p16-CDK复合物共存且不干扰细胞周期调控功能。这种稳定而不干扰的特性，解决了传统分子伴侣可能影响蛋白正常功能的难题。且不同于针对特定突变的稳定工具，NB06和NB09可稳定分布于p16不同区域的多种突变体，这显示出其在应对多种p16失活突变类型方面的潜力，具有更广泛的应用前景。
这项研究成功筛选出20种抗p16纳米抗体，其中NB06和NB09能以纳摩尔级亲和力结合p16，显著提升野生型及多种癌症相关突变体的结构稳定性。解析的p16-NB09复合物晶体结构显示，纳米抗体结合于p16的CDK结合面对立面，可形成三元复合物且不影响p16-CDK6相互作用。细胞实验证实纳米抗体能在胞内结合p16并维持其功能，为开发p16靶向的药理学分子伴侣奠定了基础。
武汉纳博生命科技有限公司是由武汉产业创新发展研究院牵头成立建设的纳米抗体产业平台。其总部位于武汉东湖新技术开发区武创院本部大楼,在武汉生物城精准医疗产业基地拥有占地面积达1400㎡的自主实验室,并在武汉左岭与黄冈团风分别建立了符合实验动物标准的羊驼实验基地与转运基地,目前基地在饲养的羊驼共600余头,可为科研机构及抗体药物研发企业提供“零免疫背景”保障的羊驼免疫服务。
纳博生命专注于纳米抗体开发、改造与应用，致力于构建产、学、研一体化的实验公共服务平台。现拥有从抗原制备(多肽、蛋白及RNA)，到抗体发现和抗体工程，再到生物学功能验证/筛选的全链路技术平台。其中RNA抗原包括针对羊驼进行RNA结构和序列优化的RNA；抗体发现与抗体工程服务采用噬菌体展示、RNA以及哺乳动物细胞展示在内的多种技术路线。通过多平台的交叉互补为药企及科研院所提供灵活的抗体发现及改造服务，助力药物试剂的研发。
除纳米抗体天然文库外，纳博生命科技还推出了现货免疫库，帮助客户快速筛选符合需求的抗体分子。
联系方式：400-822-9180 丨 联系邮箱：marketingdept@nanobodylife.com